WX-081和Bdq对5株NTM标准菌株的最低杀菌浓度（MBC）均＞32×MIC。WX-081或Bdq与5株参考菌株的MBC/MIC比值远高于4，表明两种药物对脓肿分枝杆菌■★★★、偶然分枝杆菌■■★◆◆■、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌均具有抑菌活性（表3）。

　　使用CCK-8细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒检测不同浓度的Bdq和WX-081的细胞毒性。使用Multiskan Go酶标仪（美国赛默飞世尔科技公司）测定450 nm下的吸光度值（Abs）。

　　图1 Bdq和WX-081对4种最流行的NTM菌种的MIC分布◆■★◆★◆。A：脓肿分枝杆菌的Bdq MIC分布，B：脓肿分枝杆菌的WX-081 MIC分布■◆。C◆■◆：堪萨斯分枝杆菌的Bdq MIC分布，D◆◆■★◆：堪萨斯分枝杆菌的WX-081的MIC分布■★★◆。E◆★◆◆★：鸟分枝杆菌的Bdq MIC分布◆★■★◆■，F：鸟分枝杆菌的WX-081 MIC分布■■。G：胞内分枝杆菌的Bdq MIC分布，H：胞内分枝杆菌的WX-081的MIC分布。浅灰色的点表示当MIC值变化时应变的累积频率。条形图表示与MIC值对应的频数◆■。

　　使用人单核细胞白血病细胞系（THP-1细胞）检测Bdq和WX-081的毒性，将细胞接种到96孔板中，用100 nM 丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）诱导分化为巨噬细胞。48 h后，细胞清洗一次，在含有10%胎牛血清（RPMI完全培养基）的新鲜RPMI培养基中培养。分别加入药物浓度1~16 μg/ml，再孵育24 h和48 h。

　　通信作者及单位◆★◆：初乃惠和黄海荣★◆★★■■：北京胸科医院结核一科/北京胸科医院国家结核病临床实验室

　　作者：朱芮、尚园园、陈素婷、肖华、任汝彦、王芬■★◆★、薛毅、李磊、李永国◆★、初乃惠■◆★、黄海荣

　　注◆★◆：除非特别声明，本公众号刊登的所有文章不代表《中国防痨杂志》期刊社观点。

　　图2 A：Bdq和WX-081对脓肿分枝杆菌MIC值之间的相关性◆■★■。B★◆■★■：Bdq和WX-081对堪萨斯分枝杆菌MIC值之间的相关性。C：Bdq和WX-081对鸟分枝杆菌MIC值之间的相关性■◆◆■。D：Bdq和WX-081对胞内分枝杆菌MIC值之间的相关性

　　WX-081对不同NTM具有较强的抗菌活性★■★◆◆，细胞毒性低★◆■◆★◆，因此可能被认为是一种有应用潜力的NTM病治疗候选药物。

　　根据MIC值的分布曲线确定ECOFF值◆◆■★，ECOFF值定义为单峰MIC分布中抑制95%的临床菌株生长所对应的药物浓度★■。

　　4种最常见的NTM菌种对Bdq和WX-081的MIC分布如图1所示。临床分离株对Bdq和WX-081的敏感性与标准菌株一致，即对绝大多数SGM分离株均具有较强的抑菌活性■★■★◆★。对脓肿分枝杆菌也有类似的活性，但其MIC值相对高于SGM。

　　在与抗生素孵育3 d或7 d后◆★■★，通过CFU计数法测定96孔板中5株NTM参考菌株的MBC。根据CLSI指南，MBC由最终接种量的99.9%杀死量来测定◆◆■。Bdq和WX-081的浓度范围均为1×MIC～128×MIC■★★■。RGM孵育3 d★★，SGM孵育7～10 d■◆★■■◆。每孔100 μl的培养等分放置在含或不含5%OADC的CAMHB上进行培养。RGM在7～10 d或SGM在28 d后计数CFU★■◆◆■★。根据CLSI指南，MBC被定义为CFU中最低的有效药物浓度，至少比初始CFU低3 log10。当MBC/MIC比值＞4时，抗生素被认为具有杀菌活性；否则，具备抑菌活性。

　　第一作者及单位■◆■■■★：朱芮、尚园园和陈素婷：北京胸科医院结核一科/北京胸科医院国家结核病临床实验室

　　Bdq和WX-081两种药物均溶解于二甲亚砜中。无菌条件下，制备8 mg/ml药物储液■◆■■。微量肉汤稀释法按照临床和实验室标准研究所（CLSI）指南进行★■★。SGM采用富含5%OADC的MH培养基◆◆★■★★，RGM采用不含OADC的MH培养基■★。微量肉汤稀释倍数为2倍■★◆■★◆，Bdq和WX-081的浓度范围为0.0039～2.0μg/ml。将每株菌株制备成浊度为0.5麦氏的菌液，按照1★◆★■：200的比例将菌液接种到微孔板中。然后★◆◆，在37 °C下孵育3 d（RGM）或7～10 d（SGM）★★◆◆★◆。每孔加入含有20μl alamarBlue和50 μl 5%吐温80的混合溶液，在37 °C下孵育24 h◆★■◆，然后进行结果判读■◆■，MIC值被定义为颜色从蓝色到粉红色变化的抗生素最低药物浓度◆◆。

　　对北京胸科医院（中国北京）生物样本库中保存的50株分枝杆菌标准株进行检测，其中有26株快生长分枝杆菌（rapidly growing mycobacterium★◆◆■，RGM）和24株慢生长分枝杆菌（slowly growing mycobacterium，SGM）。这些标准菌株的种的组成见表1、2。通过在含对硝基苯甲酸培养基上的生长试验和16S rRNA■★、hsp65、rpoB、16-23S rRNA转录间隔区的序列比对，将132株NTM临床分离株鉴定到菌种或亚种水平◆★■■■★。包括40株脓肿分枝杆菌、29株胞内分枝杆菌◆■★★■、21株鸟分枝杆菌和42株堪萨斯分枝杆菌。

　　WX-081对不同NTM具有较强的抗菌活性，细胞毒性低，因此可能被认为是一种有应用潜力的NTM病治疗候选药物。

　　药物孵育24 h后，16 μg/ml时THP-1细胞活力＞75%★◆◆，8 μg/ml 时THP-1细胞活力超过90%■★◆，4 μg/ml时浓度达100%■★◆◆■。16 μg/ml 药物孵育48 h时，细胞活力下降至75%以下，8 μg/ml 药物孵育48 h时，细胞活力达到75%以上。然而◆■◆★，与药物孵育48 h后，仅在1 μg/ml 时细胞活力达到100%。虽然WX-081的细胞活力低于Bdq，但Bdq与WX-081之间的差异无统计学意义（图3）。

　　二★■◆★■★、Bdq和WX-081抑制不同NTM临床分离株生长的MIC分布和流行病学临界值

　　全球非结核分枝杆菌（non-tuberculous mycobacteria，NTM）病例的迅速增加使NTM病成为一个严重的公共卫生问题。在高流行地区，NTM分离数可占分枝杆菌分离总数的30%～50%★★■。目前已有超过200个NTM菌种或亚种被报道。较为常见的NTM肺病通常是由鸟分枝杆菌复合体（Mycobacterium aviumcomplex◆◆■，MAC）、堪萨斯分枝杆菌和脓肿分枝杆菌感染引起。因为不同的NTM菌种对大多数抗生素的自然耐药性，NTM病的治疗通常具有挑战性■■★◆★。因此，开发高活性的抗NTM药物是建立有效治疗方案的基础。某些用于耐多药结核病（multidrug-resistant tuberculosis◆■★，MDR-TB）治疗的新药也可能对NTM具有很强的抗菌活性。贝达喹啉（Bedaquiline◆■◆，Bdq）是一种被推荐用于耐药结核病治疗的新型抗生素，它可通过抑制ATP合成来靶向结核分枝杆菌■◆。2019年，世界卫生组织（World Health Organization ■★★◆★■，WHO）将Bdq列为MDR-TB标准治疗方案的核心药物■◆■◆★。Bdq在体外和体内对MDR-TB均表现出很强的抗菌活性，在体外对多种NTM表现出较强的活性。但Bdq的使用可能引起某些严重的药物不良反应◆■■★★，如不明原因的死亡和QT间期延长■■◆★★。一项对1303例患者进行的meta分析显示◆★■★，在临床使用中，QT间期延长的发生率为10.6%，有0.9%的患者因QT间期延长而停止服用Bdq。舒达吡啶（WX-081）是一种新的抗结核候选药物，它在Bdq的结构基础上进行了优化。基于动物模型的体外和体内试验的研究表明■■，与Bdq相比◆■★★■，WX-081对结核病具有相当的疗效，但具有较低的心脏毒性和更有利的药代动力学特性。因此★■◆，WX-081被认为是一种很有前途的抗结核候选药物，目前正在中国进行二期临床试验研究。为了更好地了解WX-081对NTM的抗菌活性，我们对最常见的几种NTM临床分离株进行了体外抑制和细胞内杀菌活性的评估◆★◆，并分析了其细胞毒性。旨在阐明WX-081对临床常见的NTM分离菌株的抗菌性◆■★■，评估其用于NTM病治疗的潜力◆◆★◆★。